Молярная активность — важнейшая характеристика меченого соединения, причем по нескольким причинам.

Во-первых, вы можете оценить долю собственно меченых соединений в препарате, предложенном вам для работы. Например, если препарат L-[35S]-метионина имеет молярную активность 300 Ки/ммоль, то, учитывая теоретическую молярную активность (1491 Ки/ммоль) для серы-35, нетрудно подсчитать, что в препарате только пятая часть молекул содержит изотоп 35S (300 : 1491 = 1/5), а остальные — "холодные" молекулы — не содержат радиоактивных атомов. Во-вторых, можно подсчитать молярную концентрацию меченого препарата. Для этого надо разделить объемную активность препарата (Ки/мл) на его молярную активность (Ки/ммоль) и получить концентрацию вещества в растворе в ммоль/мл (моль/л). Только будьте внимательны к единицам и множителям, чтобы не разделить объемную активность в мКи/мл на молярную активность в Бк/моль (или наоборот).

В-третьих, вы можете оценить предельно достижимую для вашего препарата чувствительность обнаружения соединения. Так, если ваш препарат [γ-32P] ATP имеет молярную активность 1000 Ки/ммоль, то, учитывая границу достоверной количественной регистрации фосфора-32 в 10-10 Ки, вы сможете определить 10-10 / 103= 10-13 ммоль, т.е. 10-16 моль вещества. К сожалению, эта замечательная чувствительность на практике часто остается недостижимой, т.к. в количественных измерениях в life science обычно "биологический фон" эксперимента гораздо выше физического или приборного. Это подробно будет обсуждаться на примере использования соединений, меченных фосфором-32.

Следует подчеркнуть один очень интересный феномен, связанный с молярной активностью. Если молярная активность меченого препарата близка к теоретически возможной (более 90% от максимальной), то, независимо от периода полураспада радионуклида, величина молярной активности препарата будет практически постоянной. Это хорошо видно на примере 33Р-ортофосфорной кислоты с молярной активностью около 5000 Ки/ммоль. Действительно, согласно схеме радиоактивного распада фосфор-33 превращается в серу-33 и, следовательно, вместе с убыванием количества радиоактивных атомов (распадом) убывает (уменьшается) количество молекул фосфорной кислоты, т.к. из фосфорной H333РO4 образуется серная (H233SO4).

6. Радионуклид 3Н (тритий)

Тритий — радиоактивный изотоп водорода, "чистый" β-излучатель, который легко нарабатывается в реакторе в значительном количестве.

Схема распада: 3Н —> e + 3He

Для life science тритий является самым востребованным и удобным радионуклидом по нескольким соображениям. Во-первых, практически любую органическую молекулу можно пометить тритием (лишь бы содержала водород). Во-вторых, тритий легко вводится в разные соединения, и химия этих процессов разработана лучше, чем для любого другого радионуклида. В-третьих, тритий — это самый дешевый радионуклид, из используемых в life science. Есть прекрасная подробная монография по синтезу соединений, меченных тритием, (В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Н.Ф. Мясоедов, "Меченные тритием липофильные соединения" Москва, изд. "Наука" 2003г.), поэтому я только кратко перечислю основные методы получения 3Н-соединений.

28.                    Химический синтез гидрированием 3Н2 ненасыщенных связей, дегалоидирование и восстановление гидроксильных или карбонильных соединений.

29.                    Каталитический или термоактивированный водородный обмен.

30.                    Модификация соединений с помощью 3Н-метильных или 3Н-ацетильных групп.

31.                    Гидрирование Li[B3H4] или Li[Al3H4]

32.                    Введение 3Н за счет тритиевой воды (гидролиз или обмен).

33.                    Ферментативный синтез из 3Н-меченых предшественников.

Можно добавить биосинтез — выращивание микроорганизмов на среде, содержащей 3Н-предшественник (например, [метил-3H] тимидин, для получения меченой ДНК), с последующим выделением целевого соединения. Однако, этот способ достаточно специфический и обычно применяется только в лабораторной практике для получения биополимеров.

Исторически так сложилось, что меченые тритием компоненты нуклеиновых кислот и аминокислоты стали инструментами для нескольких поколений ученых. Позднее к тритию добавился фосфор-32 (и фосфор-33) для нуклеиновых кислот и сера-35 для белков, и доля работ с тритием в этих направлениях снизилась.

Для исследователей липидов, простагландинов, гормонов, углеводов, антибиотиков, витаминов и многих других классов соединений, тритий — главный (часто единственно доступный) инструмент повышения чувствительности методов. Это же касается исследований рецепторов, модуляторов и вообще "сигнальных" систем организмов. Поэтому тритий, не имеющий пока особых альтернатив, по-прежнему, остается основным "рабочим" радионуклидом в life science.

Главным недостатком трития является трудность его детекции и количественного измерения из-за слишком "слабого" β-излучения. Наиболее эффективный способ измерения — жидкостной сцинтилляционый счет, о котором более подробно дана информация в разделе 2.2. Особо следует подчеркнуть, что именно для трития снижение эффективности счета ("гашение") играет существенную роль в количественных измерениях.

Авторадиография тритиевых соединений тоже имеет ряд специфических особенностей. Прямая детекция β-излучения трития фоточувствительным материалом — процесс очень долгий и используется редко. Зато была предложена оригинальная модификация, согласно которой образец, содержащий тритий, обрабатывается сцинтилляционными веществами, и авторадиография превращается в своеобразную "автофлюорографию". Для пластин ТСХ — это опрыскивание раствором РРО, который уже упоминался в разделе "жидкостной сцинтилляционный счет". После высушивания такая пластинка экспонируется с рентгеновской плёнкой, и далее — как обычно.

Для ПААГ предложена процедура пропитки геля тем же РРО. Сначала приходится заместить воду в геле на диметилсульфоксид (DMSO), т.к. РРО нерастворим в воде. Затем гель пропитывают раствором РРО в DMSO, после чего обратно замещают DMSO на воду (РРО выпадает в геле в осадок и гель становиться белым). После всех этих процедур гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. "Занудность" этих операций окупается сторицей — получается возможность детекции продуктов, меченных тритием, (например пептидов, меченных 3Н-лейцином) сразу после электрофореза в ПААГ.

Еще одна "деликатная" сторона использования соединений, меченных тритием, — это химическая стабильность таких соединений. Как ни странно на первый взгляд, но радиолиз — химическое разрушение молекул под действием ионизирующего излучения — именно для соединений трития играет весьма существенную роль. Это важно помнить, т.к. большой период полураспада (12 лет) якобы позволяет использовать синтезированные вещества в течение месяцев ( а иногда и лет) с момента паспортизации. Здесь надо быть очень осторожным, т.к. часто при неправильных условиях хранения вместо целевого соединения остается сложнейшая смесь продуктов радиолиза, где нужного соединения не более трети. Типичная ошибка — хранение водного раствора тритиевого соединения в замороженном виде. В замороженном виде высокомеченные тритием соединения "рассыпаются" гораздо быстрее, чем в растворе. Поэтому для длительного хранения меченых тритием соединений при -20°С обязательно добавляют спирт или другой "антифриз", препятствующий замерзанию раствора.

С химической стабильностью соединений трития связана еще одна проблема. Устойчивость химической связи водорода (любого изотопа водорода) с другими атомами в молекуле зависит от природы этой связи. Соответственно, возможность обмена водорода в молекуле меченого соединения с растворителем, например с водой, обязательно надо учитывать. Водород карбоксильной группы в воде за счет электролитической диссоциации обменивается мгновенно, а водород в алкильном или арильном фрагменте молекулы обменивается очень трудно — при нормальных условиях обмена нет. Между этими "крайними" примерами находится огромное многообразие молекул с разной способностью к "водородному обмену", и для разных биохимических процессов вопрос о стабильности тритиевой метки может быть или чрезвычайно актуальным или совершенно несущественным.

7. Радионуклид 14C

Радионуклид 14C получают облучением нитрида алюминия по реакции:

14N + 0n —> 14C + 1p

в виде 14C-карбида. Из него 14C выделяют в виде 14CО2, который обычно поглощают Ba(OH)2, и полученный 14C-карбонат является основным радиоактивным сырьем для всех синтезов 14C-соединений. Всё обилие 14C-меченых соединений в каталогах разных фирм-производителей синтезируется двумя путями:

34.                    Биосинтез. В питательную среду к микроорганизмам (обычно это водоросли типа хлореллы) добавляют 14CО2 в качестве единственного источника углерода. После выращивания из биомассы выделяют равномерно меченые 14C-соединения. Таким путем получают аминокислоты, нуклеозиды, сахара, липидные компоненты и другие природные соединения. Иногда 14C-биомассу водорослей используют как источник углерода (своего рода меченый пептон) для выращивания штамма-продуцента какого-нибудь важного соединений.

35.                    Химический синтез. Синтез всего многообразия органических веществ из карбоната — классическая задача органической химии. Знаменитые цепочки превращений органических соединений (кошмар многих поколений студентов и школьников) в полной мере реализованы в синтезе 14C-соединений. Все органические соединения, которые не удается получить биосинтезом, синтезируют химически.

Схема распада углерода-14: 14C —> 14N + e. Хотя с детекцией 14C особых проблем не возникает, применение 14C-соединений в life science крайне ограничено. Это связано с очень низкой молярной активностью 14C-соединений, и даже кратно меченые молекулы не меняют ситуацию радикально. Обычно молярная активность 14C-соединений не превышает 20÷50 мКи/ммоль, (у соединений трития почти в 1000 раз выше, а у фосфора-32 или 33 еще в 100 раз выше) и, следовательно, по чувствительности методы с использованием 14C-соединений значительно уступают методам, в которых используют 3Н-соединения. На сегодняшний день 14C-соединения прочно удерживают за собой только одну "нишу" в life science — это изучение метаболизма новых лекарственных (или косметических) препаратов. Для изучения деградации, накопления в органах, скорости и путей выведения, биодоступности и прочих аспектов метаболизма равномерно меченые 14C-соединения остаются востребованными, несмотря на очень высокую стоимость и трудоемкость синтеза.

8. Радионуклиды 32P и 33P

Радионуклиды 32P и 33P — очень удобны для life science, но их применение ограничено природой, т.к. фосфор в природных органических соединениях присутствует гораздо реже, чем водород, углерод или кислород.

Получение радиоактивных изотопов фосфора (32Р и 33Р) с технической точки зрения одинаково: облучение элементарной серы особой чистоты в ядерном реакторе.

Однако, с экономической точки зрения разница колоссальная. Дело в том, что 32Р получают по реакции 32S + 0n —> 32P + 1p в виде 32P-ортофосфата. Стартовый материал мишени — природная элементарная сера, содержащая более 92% стабильного изотопа 32S. Изотоп 33Р получают по реакции 33S + 0n —> 33P + 1p также в виде 33P-ортофосфата. Но мишенью для этой реакции служит изотоп 33S, содержание которого в природе составляет доли процента. Для получения 33Р высокого качества необходимо использовать для облучения только 33S с обогащением не ниже 98,5÷99,0%. Это сразу существенно увеличивает стоимость продукта, т.к. стоимость обогащенной серы-33 больше природной серы примерно на 6 порядков (в миллион раз). Поэтому соединения фосфора-33 всегда будут дороже аналогичных соединений, меченных фосфором-32.

Схемы распада радионуклидов фосфора : 32P —> 32S + e и 33P —> 33S + e

Исходным радиоактивным сырьем для получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, всегда является ортофосфорная кислота (32Р или 33Р соответственно). Так как химия и биохимия 32Р и 33Р абсолютно одинаковы, в дальнейшем речь пойдет о фосфоре-32, с учетом того, что все это распространяется и на фосфор-33. В особых случаях, когда необходимо, будут отмечаться различия. Собственно сама 32Р-орто-фосфорная кислота в life science используется редко. Обычно это выращивание микроорганизмов (бактерий или дрожжей) или культуры клеток в среде, содержащей 32Р-ортофосфат. Полученную меченую биомассу отделяют от культуральной жидкости, а затем исследуют. Несколько замечаний по этому процессу.

36.                    Исходная 32Р-ортофосфорная кислота без носителя (этот термин означает, что в препарат не добавляли специально нерадиоактивную ортофосфорную кислоту) имеет молярную активность не менее 5000 Ки/ммоль, и, соответственно, концентрация собственно фосфата в среде только за счет радиоактивного фосфора будет не выше 10-8 М. Для биологических (микробиологических) работ такая концентрация фосфата в среде слишком низкая — клетки будут "считать", что фосфора нет вообще. Поэтому в культуральную среду обязательно добавляется "холодный" фосфат в концентрации, необходимой для усваивания. Обычно это не ниже 10-4 М. Не пытайтесь "включить" радиоактивный фосфат в культуру клеток без "холодного" носителя. Часть радиоактивного фосфата просто сорбируется на поверхности посуды или клеток, а включения в клеточный обмен не произойдет.

37.                    Оптимальная концентрация фосфата для таких экспериментов подбирается индивидуально для разных задач и видов клеток. "Переносить" данные по оптимальной концентрации с одного вида экспериментов (или клеток) на другой надо осторожно.

Основными соединениями фосфора-32, применяемыми в life science, являются нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные в альфа или гамма положении. В конце 60-х — начале 80-х годов ХХ века было разработано несколько способов синтеза этих соединений, но после работы Джонсона и Валсеса, предложенный ими ферментативный способ стал рутиной как для лабораторного синтеза, так и для масштабного производства. Химические методы синтеза меченных фосфором-32 соединений используются, когда нет ферментативного пути, например для синтеза синтетических аналогов нуклеотидов.

Измерение активности радионуклидов 32Р и 33Р — операция достаточно простая — любой жидкостной сцинтилляционный β-счетчик считает 32Р и 33Р с эффективностью не ниже 90%. Для фосфора-32 использование сцинтиллятора совсем не обязательно. Обычно измерение фосфора-32 проводят за счет "свечения Черенкова" — эффекта, обусловленного взаимодействием высокоэнергетических электронов с окружающей средой. Не вдаваясь в физические аспекты Черенковского свечения, следует знать, что сцинтилляционные счетчики "считают" фосфор-32 без всякого сцинтиллятора с эффективностью около 30%. Черенковское свечение фосфора-32 можно легко увидеть. Нанесите на подложку (пластинку ТСХ или фильтровальную бумагу) 1 мкл раствора 32Р-ортофосфорной кислоты (или любого другого соединения фосфора-32) с активностью 50 мкКи (около 2МБк) и поместите подложку между плоскостями двух кусков обычного стекла, толщиной 4÷5 мм. В темноте (только без "красного" света) через 3÷5 мин. адаптации глаза будет хорошо видно зеленовато-голубое свечение пятна, соответствующего точке нанесения раствора на подложку. Не подносите такой источник близко к глазам — все прекрасно видно с расстояния 40÷60 см.

Весьма полезным для работы является возможность измерения фосфора-32 прямо в пластиковых пробирках, помещенных в стандартный сцинтилляционный флакон. На практике это означает, что вы можете измерять активность своего образца, например, вырезанный кусок из агарозного геля или пробирку с фракцией элюата хроматографического разделения, а затем использовать образец для дальнейшей работы. Такая особенность фосфора-32 является его важнейшим преимуществом перед другими β-радионуклидами, применяемыми в life science. Все остальные β-радионуклиды, приведенные выше в таблице 1, включая фосфор-33, требуют для измерения в сцинтилляционном счетчике прямого контакта с сцинтилляционной жидкостью, т.е. добавления образца прямо во флакон, содержащий сцинтиллятор. Естественно, после этого образец для дальнейшей работы теряется.

Среди радионуклидов, применяемых в life science, фосфор-32 является "рекордсменом" по чувствительности методик с его использованием. Однако, простой расчет чувствительности метода (поделите обычный предел обнаружения фосфора-32, т.е. около 3÷4 Бк, на максимальную молярную активность используемого соединения, т.е. около 2х1017 Бк/моль) показывает величину около 10-17 моля. К сожалению, это неправильно. Причина этого в высоком "биологическом" фоне. Например, при постановке ДНК-полимеразной реакции контрольная проба, в которую добавляют все компоненты реакции кроме фермента, также показывает некоторое "включение" радиоактивного фосфора в ДНК, на самом деле обусловленное просто неспецифической сорбцией радиоактивного предшественника биосинтеза. Такая неспецифическая сорбция есть всегда в любом биохимическом эксперименте и фактически чувствительность метода будет определяться величиной этого "биологического" фона. Например, в реакцию добавлено 0,1 МБк [α-32P] dNТР (это примерно 2х106 срм по Черенкову), ферментативое включение в ДНК около 30%, а неспецифическая сорбция — фон — составляет около 0,1%, т.е. 2х103 срм. Граница достоверности определяемой величины будет определяться именно неспецифической сорбцией (в этом примере 2х103 срм), которая обычно гораздо выше фона измерительной аппаратуры. В этом примере фон 2000 срм, и, следовательно, достоверная величина измеряемого эффекта должна быть не ниже 6000 срм, что в 30 раз снижает чувствительность по сравнению с "идеальной" расчетной.

Использование фофора-32, а позднее и фосфора-33, начиналось еще в 50-х годах ХХ века, однако после разработки методов секвенирования ДНК с помощью фосфора-32 спрос на соединения, меченные фосфором-32, достиг просто огромных величин. В "пике" потребления нуклеотиды, меченные фосфором-32, производились в мире в объеме несколько десятков кюри ежемесячно (это десятки тысяч фасовок каждый месяц), и только флюоресцентные методы секвенирования спустили потребление радиоактивного фосфора с заоблачных высот к нынешнему состоянию.

Традиционно меченые фосфором нуклеотиды используются по нескольким направлениям:

38.                    Введение в ДНК (РНК) за счет нуклеозид-5' — [α-32Р]-трифосфатов и изучение соответствующих ферментов.

Страницы: 1, 2, 3, 4