Было установлено, что при введении крысам эпиталамин достоверно снижал хемилюминесценцию сыворотки (в 2.8 раза) и перекисное окисление липидов, что проявлялось, в частности, в выраженном снижении содержания диеновых конъюгатов (в 4.1 раза), тогда как карбонильные продукты ПОЛ, определяемые по образованию Шиф-фовых оснований с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), демонстрировали только тенденцию к снижению (на 14 %). Их этих наблюдений следует, что введение эпиталамина сказывается на начальных этапах ПОЛ. Мелатонин также подавлял ПОЛ, как следует из снижения как диеновых конъюгатов, так и ТБК-реактивных продуктов. Следует отметить, что введение мелатонина приводило к достоверному повышению уровня карбонилированных белков (на 12 %, р<0.05), тогда как эпиталамин не влиял на этот показатель. Через неделю после начала введения эпиталамина активность СОД в крови крыс достоверно возросла на 20 %, тогда как мелатонин снизил активность СОД на 32 %. Те же тенденции наблюдались и в уровне церуплазмина сыворотки, хотя изменения не выходили за пределы нормы (Anisimov et al., 2001).
Наши результаты подтверждают наличие собственной антиоксидантной активности мелатонина (Reiter, 1995). Следует подчеркнуть, что, хотя антиоксидантное действие отмечено и у мелатонина, и у эпиталамина, механизмы в этих случаях, скорее всего, разные. У эпиталамина они связаны не с собственной антиоксидантной активностью, а с активацией ферментативных антиоксидантных систем организма. Этому предположению соответствуют данные о том, что мелатонин обладает сходной антиоксидантной активностью in vivo и in vitro, тогда как эпиталамин более активен in vivo, чем in vitro (Anisimov et al., 2001).
В целом полученные данные свидетельствуют о том, что эпиталамин усиливает антиоксидантную защиту организма и это может вносить вклад в его геропротекторную активность. Антиоксидантное действие эпиталамина может быть опосредовано стимуляцией секреции мелатонина, а также активности СОД и других антиоксидантных ферментов.
Таким образом, пептидные биорегуляторы благотворно влияют на продолжительность жизни и частоту развития спонтанных опухолей у животных, а также на ряд факторов, имеющих важное значение в канцерогенезе, в частности свободнорадикальные процессы и иммунные реакции.
Сведения о биологической активности пептидного препарата эпифиза эпиталамина представлены в ряде недавних публикаций (Anisimov et al., 1994; Khavinson, 2002). Показано, что эпиталамин стимулирует синтез эпифизом серотонина, N-ацетилсеротонина, мелатонина, а также ночную секрецию мелатонина у взрослых и старых крыс. У самок старых крыс данный препарат снижает уровень ЛГ и пролактина, уменьшает порог чувствительности гипоталамо-гипофизарной системы к ингибирующему действию эстрогенов, Эпиталамин увеличивает уровень трииодтиронина и уменьшает уровень тироксина в сыворотке взрослых крыс, снижает уровень кортикостерона в сыворотке мышей и повышает чувствительность гипоталамо-гипофизарной системы к гомеостатическому торможению адренокортикотропной функции глюкокортикоидами у старых крыс. У кроликов под действием эпиталамина снижается уровень инсулина и триглицеридов в сыворотке крови, тогда как толерантность к глюкозе повышается, В отношении иммунной функции установлено, что у взрослых и старых мышеи под действием пептидного препарата эпифиза стимулируется Т- и В-клеточный иммунитет, в сыворотке растет титр тимусного сывороточного фактора (ТСФ), титр тимозиновых компонентов, а также колоние стимулирующая активность спленоцитов у пинеалэктомированных крыс (Anisimov et a)., 1994; Khavinson, 2002). Выше уже отмечалось, что эпиталамин - сильный антиоксидант. Отчетливым антиоксидантным эффектом обладает также эпиталон, как это было установлено в опытах на мышах (Anisimov et al., 2001b).
В поддержании клеточного гомеостаза в тканях принимают участие клетки диффузной нейроэндокринной системы (ДНЭС). Было показано (Khavinson, 2002), что у крыс пинеалоэктомия сопровождается характерными изменениями в соотношениях различных. клеток ДНЭС в желудке и щитовидной железе. Введение эпиталона нормализовало эти соотношения. В данном случае возможность того, что действие эпиталона опосредовано эпифизом, исключается. Таким образом, эпиталон может способствовать нормализации тканевого гомеостаза прямым действием на клетки ДНЭС.
Известно, что с возрастом снижается чувствительность гипоталамо-гипофизарного комплекса, регулирующего секрецию гонадотропинов, к гомеостатическому торможению их секреции эстрогенами, что вносит вклад в возрастное выключение репродуктивной функции (Dilman, Anisimov, 1979). Эпиталамин, введенный старым самкам крыс, повышал чувствительность гипоталамо-гипофизарной системы к эстрогенам и восстанавливал циклическую деятельность яичников животных с персистирующим эструсом (Анисимов и др., 1973). В то же время эпифизэктомия, а также содержание крыс в условиях круглосуточного освещения, угнетающего функцию эпифиза, приводили к ослаблению ингибирующего действия эстрогенов на гонадотропную функцию гипофиза. Эксперименты показали, что тогда как у 38% самок крыс в возрасте 16-18 месяцев в контрольной группе наблюдались нарушения эстрального цикла (постоянный эструс - 23 %; повторные псевдобеременности - 15 %), у животных, которым вводили эпиталамин, нарушения эстральной функции были выявлены только в 7% случаев (р<0.05). У крыс молодого и зрелого возраста (3 и 17-19 месяцев) эпиталамин практически не влиял на соотношение фаз эстрального цикла. У старых крыс (26-28 месяцев) со стойким постоянным эструсом препарат вызывал появление фаз диэструса и восстановление нерегулярного цикла, что характерно для животных более молодой возрастной группы. Сходные данные были получены при введении эпиталона трансгенным мышам HER-2/neu (Anisimov et a)., 2002).
Эти наблюдения находятся в соответствии со способностью эпиталамина восстанавливать репродуктивную функцию у крыс. К 16 самкам в возрасте 16-18 месяцев с установившимся постоянным эструсом были подсажены на две недели зрелые (8-10 месяцев) самцы, после чего за крысами продолжали наблюдение в течение 21 дня. Ни в одном случае у крыс беременности не наступило. После этого самкам в течение 3 недель (5 раз в неделю) вводили эпиталамин подкожно в дозе 2 мг. Через неделю после начала инъекций к самкам вновь подсаживали самцов. У 4 крыс было зарегистрировано наступление беременности и рождение 5-9 здоровых крысят у каждой (Анисимов и др., 1973). Таким образом, введение эпиталамина привело к восстановлению репродуктивной функции у 25 % животных. Полученные результаты дали основание считать, что эпиталамин позволяет устранять возрастные нарушения (аналогичные механизму климакса у женщин) в репродуктивной системе организма.
Эпиталамин также восстанавливал регулярные эстральные циклы у молодых и старых самок с персистирующим эструсом, индуцированным содержанием животных в условиях круглосуточного освещения. Было отмечено существенное уменьшение числа фолликулярных кист в яичниках крыс, которым вводили эпиталамин, а также частичную лютеинизацию стенки фолликулярных кист и появление желтых тел, что свидетельствовало об овуляторном действии эпиталамина (Khavinson, 2002).
Полученные результаты свидетельствуют о нормализующем влиянии эпиталамина на репродуктивную функцию у старых животных. У самок крыс под влиянием эпиталамина происходило замедление возрастного выключения репродуктивной функции. При введении препарата старым самкам крыс восстанавливались эстральная функция, овуляция и фертильность. Вероятно, эти эффекты связаны со способностью эпиталамина тормозить возрастное снижение чувствительности гипоталамо-гипофизарного комплекса, регулирующего секрецию гонадотропинов, к действию эстрогенов и повышать эту чувствительность у старых животных (Анисимов и др., 1973). Известно, что в центральной регуляции репродуктивных функций принимают участие паравентральное и супраоптическое ядра гипоталамуса. Введение эпиталамина в течение 10 суток крысам активизировало нейросекреторные клетки в этих ядрах (Khavinson, 2002). При этом отмечено накопление нейросекреторного материала в нейрогипофизе животных.
Однократное или ежедневное введение эпиталамина в течение 5 суток в утренние часы 4-5-месячным самцам крыс приводит к существенному увеличению в эпифизе уровня серотонина, N-ацетилсеротонина и мелатонина в ночное время. У 18-20-месячных крыс аналогичное применение эпиталамина сопровождалось тенденцией к увеличению ночного подъема уровня мелатонина в эпифизе и в сыворотке крови животных. Как у молодых, так и у старых крыс эпиталамин не влиял на прямое О-метилирование серотонина в 5-метилтриптамин с последующим метаболизмом в 5-метил-оксииндолилуксусную кислоту (Anisimov et al., 1994). При электронно-микроскопическом исследовании эпифизов крыс, которым вводили эпиталамин, были выявлены признаки стимуляции активности пинеалоцитов. Интраназальное введение эпиталона крысам влияло на экспрессию гена c-fos в пинеалоцитах, которая зависит от уровня активации клеток. При интраназальном введении эпиталамина крысам, а также при внесении 10-7 М раствора эпиталамина в среду инкубации изолированного эпифиза крыс наблюдались изменения электрической активности пинеалоцитов (Khavinson, 2002).
О способности эпиталамина стимулировать функции эпифиза свидетельствуют результаты, полученные при изучении действия эпиталона на нейроэндокринную регуляцию у старых макак резусов (Khavinson et al., 2001). Эксперименты были выполнены на 6 молодых половозрелых (возраст 6-8 лет) и старых (20-26 лет) самках Масаса mulatta. Содержание мелатонина в крови у старых обезьян было достоверно ниже, чем у молодых, особенно вечером. У старых макак эпиталон в 3 раза повышал вечерний уровень мелатонина. У молодых обезьян этот эффект не наблюдался. Эпиталон не оказывал достоверного влияния на уровни ДГЕА, эстрадиола, прогестерона и тироксина. При введении старым макакам эпиталон восстанавливал циркадный ритм содержания кортизола в крови.
О действии эпиталона на эпифиз свидетельствует исследование, в котором показано, что внутрибрюшинное введение эпиталона у-облученным крысам сопровождается появлением ультраструктурных признаков усиления секреторной активности пинеалоцитов, нарушенной из-за облучения (Khavinson, 2002).
Предварительные данные, полученные И. Э. Бондаревым и соавт. (2003), говорят о том, что эпиталон в соматических клетках человека может индуцировать экспрессию энзиматического компонента теломеразы, теломеразную активность и элонгацию теломер. Возможно, что в этом может состоять механизм геропротекторного действия пептида.
Способность эпиталона оказывать одинаковое действие на организмы, далеко отстоящие друг от друга в филогенетическом отношении, может объясняться тем, что он действует на уровне транскрипционных факторов, которые относятся к числу наиболее консервативных в эволюционном отношении белков, и при этом на уровне отдельных трансфакторов (даже не их комбинаций) обнаруживается тканевая специфичность в пределах организма одного вида.
В целом ряде экспериментов, описанных выше, были получены данные, свидетельствующие о том, что при действии пептидных препаратов, представляющих собой смеси природных пептидов или отдельные сконструированные пептиды, в тканях организма происходят изменения экспрессии генов. Выдвинута гипотеза, что эффекты пептидов обусловлены их действием на уровне регуляции экспрессии генов (Морозов, Хавинсон, 1996). Для того чтобы исследовать такую возможность более подробно, был проведен эксперимент с применением техники ДНК микрочипов. В использованной модификации этот метод позволяет одновременно определять изменения экспрессии 15 247 генов. С его помощью были исследованы уровни мРНК в сердце мышей до и после введения эпиталона или вилона (Анисимов С. В. и др., 2002).
В опытах использовано 30 самок мышей линии СВА, которые получали стандартный лабораторный корм и питьевую воду без ограничений. В возрасте 6 месяцев мыши были случайным образом распределены в 3 группы по 10 особей. Мыши подопытных групп в течение 5 дней получали подкожные инъекции 1 мкг вилона или эпиталона, растворенных в 0.1 мл 0.9%-ного раствора NaCl. Животные контрольной группы получали подкожные инъекции 0.1 мл 0.9 %-ного раствора NaCl. На 6-й день все мыши были умерщвлены декапитацией на гильотине, сердца были извлечены и немедленно заморожены в жидком азоте и далее хранились при -80°С до этапа выделения тотальной РНК. В эксперименте были использованы 15 247 клонов, входящих в библиотеку кДНК, принадлежащую Национальному институту старения США (NIA mouse 15K. cDNA clone set).
В ходе эксперимента была проведена трипликативная гибридизация микрочипов, содержащих 15 247 клонов кДНК, с образцами ткани сердца мышей контрольной и подопытных групп. Было выявлено 300 клонов (1.94 % от общего числа) с более чем двукратным изменением уровня экспрессии в сердцах мышей подопытных групп по сравнению с мышами контрольной группы. Под воздействием только вилона изменялась экспрессия 36 клонов, под воздействием только эпиталона - 98 клонов и под воздействием обоих пептидов - 144 клона. Всего же под воздействием вилона изменялась экспрессия 180 клонов и под воздействием эпиталона - 242 клонов. При введении вилона отмечено изменение экспресии 157 клонов в сторону увеличения и 23 клонов в сторону уменьшения. Максимальное увеличение уровня экспрессии под воздействием вилона по сравнению с контролем составило 6.13 раза, максимальное уменьшение -- 2.79 раза. Аналогично под воздействием эпиталона отмечено изменение экспрессии 194 клонов в сторону увеличения и 48 клонов в сторону уменьшения. Максимальное увеличение уровня экспрессии под воздействием эпиталона по сравнению с контролем составило 6.61 раза, максимальное уменьшение - 2.71 раза.
Следует отметить, что при введении вилона или эпиталона менялась экспрессия 5 из 13 генов, кодируемых митохондриальным геномом. Для 4 митохондриальных генов (16S - вилон и эпиталон; НАДН-дегидрогсназа 4 и 5 и цнтохром В - только эпиталон) уровень экспрессии повышался в 2.03-6.61 раза, в то время как для гена АТФазы 6-й уровень экспрессии под воздействием вилоиа снижался в 2.25 раза.
139 ядерных генов были разбиты по категориям согласно функциональной классификации генов сердечно-сосудистой системы. 44 гена не вошли ни в одну из категорий либо являлись генами гипотетических белков. Остальные 95 генов представили все 6 основных функциональных категорий генов, в том числе гены клеточного деления (14 генов), клеточных сигнальных систем и коммуникаций (15 генов), клеточной структуры и подвижности (7 генов), защитных систем клетки и организма (16 генов), экспрессии генов и белков (24 гена), метаболизма (19 генов).
Гены, уровень экспрессии которых изменялся под воздействием вилона и эпиталона, функционально относятся к самым разным клеточным системам. При сравнении их распределения по функциональным категориям отмечено его несовпадение с нормальным распределением для генов, представленных в сердце. Гены клеточного деления и защитных систем клетки и организма представлены среди генов с измененным уровнем экспрессии значительно шире, чем в общей совокупности (10.07% в сравнении с 5.68% для категории клеточного деления; 11.51% в сравнении с 6.71% для категории защитных систем клетки и организма). Таким образом, можно предположить, что относящиеся к этим двум подклассам гены являются наиболее значимыми эффекторами биологического действия вилона и эпиталона. Более детальный анализ функциональных подкатегорий показал, что наиболее значимыми являются изменения доли генов, имеющих отношение к регуляции клеточного цикла (подкатегория 1d: 5 генов - 3.6% против 1.59% в общей совокупности), мембранного транспорта/транспортных белков (подкатегория 4bЗ: 6 генов - 4.32 % против 0.9 %) и иммунной системы (подкатегория 4с: 5 генов - 3.6% против 1.75 %). При сравнении влияния вилона и эпиталона на гены, представленные в сердце, была обнаружена относительная избирательность воздействия эпиталонз на уровень экспрессии генов, имеющих отношение к рибосомальным белкам (подкатегория 5bЗ). Вилон увеличил экспрессию лишь одного гена данной подкатегории - киназы 1 рибосомальной РНК S6 (р70/р85 86-киназы), в то время как эпиталон, кроме 86-кинази. в 2.02-2.46 раза увеличил экспрессию генов рибосомальных белков L8, L27 и РНК S6 и S10 Существенно, что ген рибосомальной РНК S10 был представлен двумя клонами, имевшими сходство с нуклеотидными последовательностями гена крысы и человека и продемонстрировавшими почти одинаковое увеличение уровней экспрессии (в 2.02 и 2.09 раза соответственно).
Важным представляется влияние вилона и эпиталона на изменение уровня экспрессии нескольких генов, имеющих отношение к он-когенезу. Обнаружено уменьшение уровня экспрессии гена, сходного с онкогеном миелобластоза (вилон) и протоонкогена Bcl-3 (эпиталон). Пептиды увеличивают уровень экспрессии генов протеинкиназы C-zeta (эпиталон), LIM/PDZ-доменных белков Энигма (эпиталон), его гомолога 2 (оба пептида), которые, как полагают, также вовлечены в онкогенез и уменьшают экспрессию функционально связанного с последними гена PDZ-доменного белка Cipp (вилон).
Также обращает на себя внимание влияние пептидов на большое число генов, имеющих отношение к обмену кальция, в частности на ген куллина-5, гены Ксnn4 и Dcamkll (экспрессия увеличивается обоими пептидами), кальмодулин (экспрессия увеличивается эпиталоном), и гены Са-связывающего белка кальбайндина и Ксnn2 (экспрессия уменьшается эпиталоном). Кроме того, в той же функциональной категории (клеточные сигнальные системы и коммуникации) обнаруживаются гены трех серин/треониновых киназ (Pctk3, FUSED, Stkl)), экспрессия которых увеличивается под воздействием обоих пептидов. По крайней мере одна из этих киназ (Stkl 1), функция которой неясна, обладает антиканцерогенными свойствами, и мутации ее гена приводят к развитию синдрома Пейтца-Егерса, сопровождающегося высоким риском развития опухолей многих локализаций, эти данные согласуются с нашими наблюдениями об угнетающем влиянии эпиталона и вилона на развитие спонтанных опухолей.
Таким образом, установлена возможность специфического влияния пептидных биорегуляторов эпиталона и вилона на экспрессию генов. Вместе с тем ясно, что в опытах в условиях целостного организма in vivo практически невозможно определить, является ли действие исследуемого фактора на данный орган прямым, или оно опосредовано прямым действием на какие-то другие органы и влиянием уже с их стороны на исследуемый орган. В частности, выше приводились факты, свидетельствующие о влиянии эпиталона и вилона на нейроэндокринную и иммунную системы, поэтому нельзя исключить возможность того, что продемонстрированные изменения экспрессии генов в сердце вызваны изменениями гормонального фона, состояния ДНЭС или секреции лимфокинов. В этой связи важно, что было показано прямое влияние вилона на экспрессию гена интерлейкина-2 в лимфоцитах (Khavinson, 2002).
Следует отметить, что при изучении влияния вилона и эпиталона на экспрессию генов получены данные об избирательном действии этих пептидов на гены, продукты которых участвуют в кальциевом гомеостазе клеток и реализуют эффекты ионов кальция, считающихся одним из важнейших компонентов систем внутриклеточной передачи сигналов. Еще один тип механизмов внутриклеточной передачи сигналов основан на протеинкиназных каскадах. В этой связи привлекают внимание данные о влиянии эпиталона на экспрессию генов некоторых серин-треониновых киназ. Кроме того, показано влияние эпиталона на экспрессию одной из протеинкиназ С, принимающих участие в фосфоинозитопьном пути передачи внутриклеточных сигналов.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28
